項(xiàng)目一：屏障修護(hù)功能相關(guān)基因表達(dá)測(cè)定
【實(shí)驗(yàn)原理】
角質(zhì)形成細(xì)胞在向上分化形成皮膚屏障的過(guò)程中，各種結(jié)構(gòu)基因會(huì)不同程度地表達(dá)，翻譯出蛋白并特異性分布在皮膚的各層中。與皮膚屏障功能密切相關(guān)的蛋白主要由細(xì)胞與細(xì)胞間的緊密連接蛋白和細(xì)胞與基質(zhì)間的錨定連接蛋白有關(guān)。而上述緊密連接蛋白中主要以有閉合蛋白（occludin）、密封蛋白（claudin)、連接粘附分子（JAM) 和 閉合小環(huán)蛋白（ZOs）為主。包括板層素（Laminin）、IV型、VII及XVII膠原蛋白又是組成錨定連接蛋白組分。本實(shí)驗(yàn)利用人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT），將樣品作用于細(xì)胞后檢測(cè)緊密連接蛋白和錨定連接蛋白基因相對(duì)表達(dá)量，來(lái)評(píng)估樣品的屏障修護(hù)功效。
【實(shí)驗(yàn)步驟】
實(shí)驗(yàn)一：MTT法檢測(cè)某化妝品對(duì)HaCaT的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
1）細(xì)胞接種：接種細(xì)胞于96孔板內(nèi)（1×10^4 個(gè)/孔），于37 ℃，5% CO2中培養(yǎng)24 h。
2）給藥：樣品組加入相應(yīng)濃度的含樣品的培養(yǎng)基，正常對(duì)照組更換為新鮮培養(yǎng)基，空白組加入空白培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。
3）孵育結(jié)束后向每孔中加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。
4）去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液，振蕩混勻，測(cè)定490 nm處吸光度值。
OD490：490 nm處的吸光度值
實(shí)驗(yàn)二：屏障修護(hù)功能相關(guān)基因表達(dá)測(cè)定
1）細(xì)胞接種：接種HaCaT細(xì)胞于6孔板中，每孔6 × 10^5個(gè)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。
2）給藥：孵育結(jié)束后，D-Hanks輕柔沖洗細(xì)胞一次或兩次，正常對(duì)照組加入新鮮培養(yǎng)基，樣品組加入含相應(yīng)濃度的樣品新鮮培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。
3）收樣及檢測(cè)：培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行細(xì)胞收樣，提取各實(shí)驗(yàn)組總RNA，合成cDNA，利用q-PCR檢測(cè)β-actin和目的基因的基因表達(dá)。
4）數(shù)據(jù)分析：用β-actin作為基因表達(dá)的內(nèi)參，計(jì)算目的基因的RNA相對(duì)表達(dá)量。
【評(píng)價(jià)指標(biāo)】屏障修護(hù)功能相關(guān)基因表達(dá)測(cè)定
【評(píng)價(jià)結(jié)論】
供試品組與對(duì)照組相比屏障修護(hù)功能相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)且具有顯著性差異（P＜0.05），初步證明該樣品具有修護(hù)功效。
【參考結(jié)論】
[1] Anna D?bińska, Matteo Megna, New Treatments for Atopic Dermatitis Targeting Skin Barrier Repair via the Regulation of FLG Expression[J]. J Clin Med. 2021,10(11): 2506.
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項(xiàng)目二：利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)供試品的皮膚屏障修復(fù)功效
【評(píng)價(jià)原理】
隨著年齡的增加，皮膚接受外來(lái)環(huán)境（物理?yè)p傷，化學(xué)試劑等）的影響，造成皮膚的日益老化，在老化的過(guò)程中，細(xì)胞的損傷逐漸積累，進(jìn)一步加速了皮膚老化。人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（human immortalized keratinocytes, HaCaT）是構(gòu)成皮膚表皮層的主要細(xì)胞類型，并且具有表皮構(gòu)成、創(chuàng)傷修復(fù)、細(xì)胞角化、細(xì)胞因子分泌和免疫監(jiān)視等功能，常被用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域作為體外皮膚研究的細(xì)胞系，例如皮膚修復(fù)愈合和防曬等，在傷口愈合的早期階段，表皮中角化形成細(xì)胞被激活，并遷移到創(chuàng)傷部位誘導(dǎo)傷口收縮，接著進(jìn)行細(xì)胞增殖以皮膚修復(fù)重建。因此，角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)于傷口愈合有重要作用。利用人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT建立劃痕實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，檢測(cè)供試品是否對(duì)細(xì)胞具有屏障修護(hù)的功效。
【實(shí)驗(yàn)方法】
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT消化重懸后進(jìn)行計(jì)數(shù)，接種6×10^5個(gè)細(xì)胞/孔培養(yǎng)（37℃、5%CO2、24h），分別設(shè)置空白組、陽(yáng)性對(duì)照組和樣品組。待細(xì)胞100%融合后，用槍頭比著載玻片，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。劃痕結(jié)束后，用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，對(duì)照組加入1%血清培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組加入含100ng/ml EGF的1%血清培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入含一定濃度受試物的1%血清培養(yǎng)基。放入37度5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0和24小時(shí)取樣，拍照，計(jì)算愈合率：
【評(píng)價(jià)指標(biāo)】HaCaT細(xì)胞修復(fù)愈合率
【評(píng)價(jià)結(jié)果】樣品組給藥24 h后的劃痕面積與正常對(duì)照組相比，明顯減少，揭示了該樣品具有修護(hù)功效。
【參考文獻(xiàn)】
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