項(xiàng)目一：黑色素含量測定
【實(shí)驗(yàn)原理】
體內(nèi)黑色素主要由位于表皮基底細(xì)胞層的黑色素細(xì)胞產(chǎn)生，是一種由細(xì)胞本身所合成、分泌不溶于水，溶于堿性溶液的生物色素。黑色素的產(chǎn)生過程受多因素調(diào)控，其中外界刺激(尤其是紫外線照射)、炎癥反應(yīng)和α-MSH激動(dòng)劑均可觸發(fā)或影響黑色素的合成過程。本實(shí)驗(yàn)利用人黑素瘤細(xì)胞在樣品作用下通過NaOH裂解法檢測黑色素含量進(jìn)而評(píng)價(jià)樣品是否具有美白功效。^
【實(shí)驗(yàn)步驟】
實(shí)驗(yàn)一：MTT法檢測樣品對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
1）細(xì)胞接種：接種細(xì)胞于96孔板內(nèi)（1 × 10^4個(gè)/孔），于37 ℃，5% CO2中培養(yǎng)24 h。
2）給藥：樣品組加入相應(yīng)濃度的含樣品的培養(yǎng)基，正常對(duì)照組更換為新鮮培養(yǎng)基，空白組加入空白培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。
3）孵育結(jié)束后向每孔中加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。
4）去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液，振蕩混勻，測定490 nm處吸光度值。
OD490：490 nm處的吸光度值
實(shí)驗(yàn)二：人黑色素瘤細(xì)胞的黑色素含量測定實(shí)驗(yàn)
1）細(xì)胞接種：接種細(xì)胞于12孔平板（5 × 104個(gè)/孔），于37 ℃，5% CO2孵育24 h。
2）造模+給藥：去除培養(yǎng)液，用D-Hanks輕柔沖洗細(xì)胞一次或兩次。正常對(duì)照組更換為新鮮培養(yǎng)基，樣品組更換為含造模劑（α-MSH）和樣品的新鮮培養(yǎng)基，模型對(duì)照組更換為含造模劑（α-MSH）的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)于37 ℃，5% CO2孵育48 h。
3）收樣檢測：孵育結(jié)束后，去除培養(yǎng)液，用D-Hanks輕柔沖洗細(xì)胞一次或兩次，每孔加入200 μL 1mol/L的NaOH溶液（含10% DMSO），60 ℃孵育1 h.。將12孔板中各組的細(xì)胞溶出物轉(zhuǎn)移到96孔板中，在475 nm處測定各孔的吸光度值。
注：上述給藥濃度均來MTT實(shí)驗(yàn)摸索而定。
【評(píng)價(jià)指標(biāo)】
黑色素含量
【評(píng)價(jià)結(jié)論】
供試品組與對(duì)照組相比，黑色素含量下調(diào)且具有顯著性差異（P＜0.05），初步證明該樣品具有美白功效。
【參考結(jié)論】
[1] 殷珊.梔子黃色素對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素生成影響的實(shí)驗(yàn)研究[D].湖南中醫(yī)藥大學(xué).
[2] 莊文越,蘇小明,趙鳴瑤,等.安五脂素對(duì)α-黑色素細(xì)胞刺激素誘導(dǎo)的小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞中黑色素生成的影響及機(jī)制[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2022,36(5):6.
[3] 解士海, 黃榮云, 趙衛(wèi)華,等. 紫草素對(duì)人黑素瘤細(xì)胞增殖及黑素合成的影響[J]. 臨床合理用藥雜志, 2010, 3(9):10-12.
[4] 劉邦民, 張涓, 陶春蓉,等. 驗(yàn)方祛斑湯含藥血清對(duì)A375人黑素瘤細(xì)胞黑素合成的影響[J]. 美中醫(yī)學(xué)：英文版, 2007, 4(6):4.
項(xiàng)目二：酪氨酸酶活性測定
【實(shí)驗(yàn)原理】
酪氨酸酶是黑色素合成的關(guān)鍵限速酶，在治療色素障礙性皮膚病中，酪氨酸酶抑制劑發(fā)揮著重要作用，近年來，以酪氨酸酶抑制劑作為美白劑開發(fā)的美白祛斑產(chǎn)品均能達(dá)到一定功效。通過多巴氧化法檢測樣品對(duì)人黑素瘤細(xì)胞（A375）中酪氨酸酶活性是否降低，來判斷樣品是否具有美白功效。
【實(shí)驗(yàn)步驟】
1）細(xì)胞接種：接種人黑素瘤細(xì)胞（A375）于96孔板中，每孔5 × 104 個(gè)，37 ℃培養(yǎng)24 ± 2 h。
2）給藥：空白對(duì)照組（不含細(xì)胞）和正常對(duì)照組（含細(xì)胞）加入完全培養(yǎng)基，樣品組加入含相應(yīng)濃度樣品的完全培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育48 h。
3）收樣檢測：孵育結(jié)束后，去培養(yǎng)基，采用多巴氧化法測酪氨酸酶活性。
上述給藥濃度均來MTT實(shí)驗(yàn)摸索而定。
【評(píng)價(jià)指標(biāo)】
酪氨酸酶活性
【評(píng)價(jià)結(jié)論】
供試品組與對(duì)照組相比，酪氨酸酶活性上調(diào)且具有顯著性差異（P＜0.05），初步證明該樣品具有美白功效。
【參考結(jié)論】
[1]楊美花，李智聰，劉鳳嬌，莊江興，王勤，陳清西. L-半胱氨酸作為化妝品美白添加劑的作用機(jī)理[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，48（4）：581-584.
[2]黃海潮，鄭公銘，王如意，張顯策，李忠軍，劉綱勇，傅中. 柯里拉京對(duì)B16細(xì)胞增殖及酪氨酸酶活性的抑制作用[J].日用化學(xué)工業(yè)，2016，46（1）：44-47.
項(xiàng)目三：黑素合成相關(guān)基因-MITF、TYR表達(dá)測定
【實(shí)驗(yàn)原理】
皮膚是抵御各種有害刺激的物理屏障，包括紫外線照射、環(huán)境污染、機(jī)械損傷和體內(nèi)水分流失。特別是，過度的紫外線照射會(huì)導(dǎo)致DNA損傷和基因突變，從而導(dǎo)致皮膚癌的發(fā)生。因此，皮膚使用黑色素，一種由表皮基底細(xì)胞層中的黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的天然色素，來保護(hù)皮膚免受過度的紫外線照射。黑色素的產(chǎn)生被稱為黑色素生成級(jí)聯(lián)，包括基因表達(dá)、酶反應(yīng)和膜運(yùn)輸。素生成級(jí)聯(lián)始于黑素細(xì)胞，通過激活G蛋白偶聯(lián)受體，黑素皮質(zhì)素1受體(MC1R)，對(duì)α-黑素細(xì)胞刺激激素(αMSH)作出反應(yīng)，αMSH作為黑色素生成的內(nèi)源性誘導(dǎo)物，通過級(jí)聯(lián)磷酸化激活黑色素合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄因子-黑素細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子（MITF），包括黑素生物合成酶酪氨酸酶家族的基因表達(dá)，例如酪氨酸酶(TYR)。因此，本實(shí)驗(yàn)利用人源黑色素瘤細(xì)胞（A375），將樣品作用于細(xì)胞后檢測MITF、TYR基因相對(duì)表達(dá)量，以此維度來評(píng)估樣品對(duì)黑色素合成的影響。
【實(shí)驗(yàn)步驟】
細(xì)胞接種：接種A375細(xì)胞于6孔板中，每孔6 × 105個(gè)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。
造模＋給藥：去除培養(yǎng)液，用D-Hanks輕柔沖洗細(xì)胞一次或兩次。正常對(duì)照組更換為新鮮培養(yǎng)基，樣品組更換為含造模劑（α-MSH）和樣品的新鮮培養(yǎng)基，模型對(duì)照組更換為含造模劑（α-MSH）的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)于37 ℃，5% CO2孵育48 h。
收樣檢測：培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行細(xì)胞收樣，提取各實(shí)驗(yàn)組總RNA，合成cDNA，利用q-PCR檢測β-actin和目的基因的基因表達(dá)。
用β-actin作為基因表達(dá)的內(nèi)參，計(jì)算目的基因的RNA相對(duì)表達(dá)量。
【評(píng)價(jià)指標(biāo)】
MITF、TYR基因表達(dá)
【評(píng)價(jià)結(jié)論】
供試品組與模型對(duì)照組相比MITF、TYR基因表達(dá)下調(diào)且具有顯著性差異（P＜0.05），初步證明該樣品具有美白功效。
【參考結(jié)論】
[1] Waku T, Nakada S, Masuda H, Sumi H, Wada A, Hirose S, Aketa I, Kobayashi A. The CNC-family transcription factor Nrf3 coordinates the melanogenesis cascade through macropinocytosis and autophagy regulation. Cell Rep. 2023 Jan 31;42(1):111906.
[2] 殷珊.梔子黃色素對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素生成影響的實(shí)驗(yàn)研究[D].湖南中醫(yī)藥大學(xué).
[3] 莊文越,蘇小明,趙鳴瑤,等.安五脂素對(duì)α-黑色素細(xì)胞刺激素誘導(dǎo)的小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞中黑色素生成的影響及機(jī)制[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2022,36(5):6.
[4] 解士海, 黃榮云, 趙衛(wèi)華,等. 紫草素對(duì)人黑素瘤細(xì)胞增殖及黑素合成的影響[J]. 臨床合理用藥雜志, 2010, 3(9):10-12.
[5] 劉邦民, 張涓, 陶春蓉,等. 驗(yàn)方祛斑湯含藥血清對(duì)A375人黑素瘤細(xì)胞黑素合成的影響[J]. 美中醫(yī)學(xué)：英文版, 2007, 4(6):4.
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