項(xiàng)目一：TNF-α和 IL-1α的表達(dá)量
【評(píng)價(jià)原理】
暴露于生活環(huán)境中的皮膚，接觸到有毒有害物質(zhì)后可能引起一定程度的皮膚炎癥，出現(xiàn)皮膚紅腫、瘙癢等現(xiàn)象?；瘖y品對(duì)皮膚的刺激表型主要表現(xiàn)為皮膚炎癥，炎癥早期主要表現(xiàn)為毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性亢進(jìn)和水腫。各種炎癥因子在急性和慢性炎癥發(fā)生過程中扮演著關(guān)鍵角色，如白細(xì)胞介素-1α（interleukin-1α，IL-1α）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹饕抢糜郎琴|(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）和 UVB 建立模型，將供試品作用于 HaCaT 后檢測(cè) TNF-α和 IL-1α的表達(dá)量，可以評(píng)估受試物舒緩的作用。
實(shí)驗(yàn)一：MTT 法檢測(cè)樣品對(duì) HaCaT 的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
1）細(xì)胞接種：接種細(xì)胞于 96 孔板內(nèi)（1 × 10^4個(gè)/孔），于 37 ℃，5% CO2中培養(yǎng) 24 h。
2）給藥：樣品組加入相應(yīng)濃度的含樣品的培養(yǎng)基，正常對(duì)照組更換為新鮮培養(yǎng)基，空白組加入空白培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育 24 h。
3）孵育結(jié)束后向每孔中加入 MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。
4）去培養(yǎng)液，加入 DMSO 溶液，振蕩混勻，測(cè)定 490 nm 處吸光度值。
OD490：490 nm 處的吸光度值
實(shí)驗(yàn)二：樣品對(duì) UVB 輻射后 HaCaT 的 TNF-α和 IL-1α 基因表達(dá)
1） 細(xì)胞接種：將 HaCaT 以 6 × 10^5個(gè)/孔接種于 6 孔板，于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)12 h，分別設(shè)置正常對(duì)照組（0 mJ/cm2+0 mM 樣品）、模型對(duì)照組（80 mJ/cm2+0 mM 樣品）低濃度組（80 mJ/cm2+AmM 樣品）、中濃度組（80 mJ/cm2+B mM 樣品）、高濃度組（80 mJ/cm2 + CmM 樣品）。
2） UVB 造模：UVB 輻射前 HaCaT 用 D’Hanks 洗 3 遍，在孔中加入 1 ml D’Hanks，使之浸沒細(xì)胞，正常對(duì)照組用錫紙包住置暗處。針對(duì)試驗(yàn)分組，對(duì)需要輻射的組分別進(jìn)行 UVB造模；
3） 給藥：各試驗(yàn)組中分別加入含有不同濃度樣品的 DMEM 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；
4）培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行細(xì)胞收樣，提取各實(shí)驗(yàn)組總 RNA，合成 cDNA，利用 q-PCR 檢測(cè)β-actin和目的基因的基因表達(dá)。
5）用β-actin 作為基因表達(dá)的內(nèi)參，計(jì)算目的基因的 RNA 相對(duì)表達(dá)量。
【評(píng)價(jià)指標(biāo)】NF-κB 基因表達(dá)
【評(píng)價(jià)結(jié)論】與模型對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組 TNF-α和 IL-1α基因表達(dá)均且具有顯著性下調(diào)且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性（P＜0.05），初步證明樣品具有抗炎功效。
【參考文獻(xiàn)】
[1] C. A. Feghali and T. M. Wright, “Cytokines in acute and chronic inflammation,” Frontiers inBioscience, vol. 2, pp. d12–d26, 1997.
[2] J. K. Kundu and Y. J. Surh, “Inflammation: gearing the journey to cancer,” MutationResearch, vol. 659, no. 1-2, pp. 15–30, 2008.
[3] C. A. Dinarello, “The paradox of pro-inflammatory cytokines in cancer,” Cancer and Metastasis Reviews, vol. 25, no. 3, pp. 307–313, 2006.
[4] Magcwebeba T, Riedel S, Swanevelder S, Bouic P, Swart P, Gelderblom W. Interleukin-1αInduction in Human Keratinocytes (HaCaT): An In Vitro Model for Chemoprevention in Skin. JSkin Cancer. 2012:393681.
項(xiàng)目二：TRPV1 基因表達(dá)
【評(píng)價(jià)原理】
炎 TRPV1 受體是一種傷害感受器，能夠被化學(xué)物質(zhì)（辣椒素）、傷害性熱刺激和酸化等多種因素激活。TRPV1 廣泛存在與 C 類感覺神經(jīng)傳入纖維及角質(zhì)形成細(xì)胞中。TRPV1 受體被激活后，單價(jià)和二價(jià)陽離子（主要為 Ca2+）進(jìn)入細(xì)胞，觸發(fā)動(dòng)作電位，傳入高級(jí)中樞系統(tǒng)，產(chǎn)生灼燒痛感。因此，通過受試物作用后，阻斷或抑制 TRPV1 受體蛋白的表達(dá)，有助于緩解灼燒痛感，達(dá)到舒緩的目的。因此，可以通過檢測(cè)樣品處理后角質(zhì)形成細(xì)胞中TRPV1 基因表達(dá)量，以此維度指標(biāo)初步判定樣品是否具有舒緩功效。
【實(shí)驗(yàn)方案】
實(shí)驗(yàn)一：MTT 法檢測(cè)樣品對(duì) HaCaT 的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
1）細(xì)胞接種：接種細(xì)胞于 96 孔板內(nèi)（1 × 10^4個(gè)/孔），于 37 ℃，5% CO2中培養(yǎng) 24 h。
2）給藥：樣品組加入相應(yīng)濃度的含樣品的培養(yǎng)基，正常對(duì)照組更換為新鮮培養(yǎng)基，空白組加入空白培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育 24 h。
3）孵育結(jié)束后向每孔中加入 MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。
4）去培養(yǎng)液，加入 DMSO 溶液，振蕩混勻，測(cè)定 490 nm 處吸光度值。
OD490：490 nm 處的吸光度值
實(shí)驗(yàn)二：樣品對(duì)辣椒素刺激后 HaCaT 的 TRPV1 基因表達(dá)
1） 細(xì)胞接種：將 HaCaT 以 6 × 10^5個(gè)/孔接種于 6 孔板，于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)12 h，分別設(shè)置正常對(duì)照組（（0 mM CAP+0 mM 樣品）、模型對(duì)照組（X mM CAP+0 mM 樣品）、低濃度組（X mM CAP+A mM 樣品）、中濃度組（X mM CAP+B mM 樣品）、高濃度組（X mM CAP + C mM 樣品）。
2） 誘導(dǎo)及給藥：棄掉 6 孔板中的培養(yǎng)液，開展給藥操作。根據(jù)以上藥物分組加入含有受試物和 CAP 貯備液的培養(yǎng)液，每孔 1 mL。給藥完畢后將 24 孔板放置在培養(yǎng)箱中（37℃、5%CO2）培養(yǎng) 24h±2h。3）孵育結(jié)束后，D-Hanks 輕柔沖洗細(xì)胞一次或兩次，正常對(duì)照組加入新鮮培養(yǎng)基，樣品組加入含相應(yīng)濃度的樣品新鮮培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2 培養(yǎng) 24 h。
4）培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行細(xì)胞收樣，提取各實(shí)驗(yàn)組總 RNA，合成 cDNA，利用 q-PCR 檢測(cè)β-actin和目的基因的基因表達(dá)。
5）用β-actin 作為基因表達(dá)的內(nèi)參，計(jì)算目的基因的 RNA 相對(duì)表達(dá)量。
【評(píng)價(jià)指標(biāo)】TRPV1 基因表達(dá)
【評(píng)價(jià)結(jié)論】
與模型對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組 TRPV1 基因表達(dá)均且具有顯著性下調(diào)且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性（P＜0.05），初步證明樣品具有抗炎功效。
【參考文獻(xiàn)】
[1] 李文海,劉青,劉欣會(huì),等.辣椒素受體在銀屑病皮損中的表達(dá)及其意義[J].臨床皮膚科雜志 2013年 42 卷 9 期, 518-521 頁, ISTIC PKU CSCD, 2013:北京大學(xué)人民醫(yī)院研究與發(fā)展基金.
[2]Ge Yiman,葛一漫,Hu Yimei,等.馬齒莧揮發(fā)油對(duì)辣椒素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)瘙癢相關(guān)通路的影響[C]//四川省醫(yī)學(xué)會(huì)第十六次檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議.2016.
項(xiàng)目三：NF-κB 基因表達(dá)
【評(píng)價(jià)原理】
炎癥是一種生理反應(yīng)，它保護(hù)身體免受各種傷害，如物理傷害、病原體、有毒化學(xué)物質(zhì)暴露和紫外線照射。各種炎癥因子在急性和慢性炎癥發(fā)生過程中扮演著關(guān)鍵角色，其中，NF-κB 被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子。大量數(shù)據(jù)表明，NF-κB 活化與炎癥之間存在正相關(guān)，例如，一氧化氮合成酶，炎性細(xì)胞因子，如 IL-6、IL-8 和 TNF-α；趨化因子 CCL2和 CXCL8 等上調(diào)。因此，可以通過檢測(cè)樣品處理后角質(zhì)形成細(xì)胞中 NF-κB 基因表達(dá)量，以此維度指標(biāo)初步判定樣品是否具有抗炎功效。
【實(shí)驗(yàn)方案】
實(shí)驗(yàn)一：MTT 法檢測(cè)樣品對(duì) HaCaT 的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
1）細(xì)胞接種：接種細(xì)胞于 96 孔板內(nèi)（1 × 10^4個(gè)/孔），于 37 ℃，5% CO2中培養(yǎng) 24 h。
2）給藥：樣品組加入相應(yīng)濃度的含樣品的培養(yǎng)基，正常對(duì)照組更換為新鮮培養(yǎng)基，空白組加入空白培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育 24 h。
3）孵育結(jié)束后向每孔中加入 MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。
4）去培養(yǎng)液，加入 DMSO 溶液，振蕩混勻，測(cè)定 490 nm 處吸光度值。
OD490：490 nm 處的吸光度值
實(shí)驗(yàn)二：樣品對(duì) UVB 輻射后 HaCaT 的 NF-κB 基因表達(dá)
1） 細(xì)胞接種：將 HaCaT 以 6 × 10^5個(gè)/孔接種于 6 孔板，于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)12 h，分別設(shè)置正常對(duì)照組（0 mJ/cm2+0 mM 樣品）、模型對(duì)照組（80 mJ/cm2+0 mM 樣品）低濃度組（80 mJ/cm2+AmM 樣品）、中濃度組（80 mJ/cm2+B mM 樣品）、高濃度組（80 mJ/cm2 + CmM 樣品）。
2） UVB 造模：UVB 輻射前 HaCaT 用 D’Hanks 洗 3 遍，在孔中加入 1 ml D’Hanks，使之浸沒細(xì)胞，正常對(duì)照組用錫紙包住置暗處。針對(duì)試驗(yàn)分組，對(duì)需要輻射的組分別進(jìn)行 UVB造模；
3） 給藥：各試驗(yàn)組中分別加入含有不同濃度樣品的 DMEM 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；
4）培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行細(xì)胞收樣，提取各實(shí)驗(yàn)組總 RNA，合成 cDNA，利用 q-PCR 檢測(cè)β-actin和目的基因的基因表達(dá)。
5）用β-actin 作為基因表達(dá)的內(nèi)參，計(jì)算目的基因的 RNA 相對(duì)表達(dá)量。
【評(píng)價(jià)指標(biāo)】NF-κB 基因表達(dá)
【評(píng)價(jià)結(jié)論】與模型對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組 NF-κB 基因表達(dá)均且具有顯著性下調(diào)且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性（P＜0.05），初步證明樣品具有抗炎功效。
【參考文獻(xiàn)】
[1] Gao J, Chen F, Fang H, Mi J, Qi Q, Yang M. Daphnetin inhibits proliferation and inflammatory response in human HaCaT keratinocytes and ameliorates imiquimod-induced psoriasis-like skin lesion in mice. Biol Res. 2020,20;53(1):48.
[2] Suter MM, Schulze K, Bergman W, Welle M, Roosje P, Müller EJ. The keratinocyte in epidermal renewal and defence. Vet Dermatol. 2009,20(5-6):515-32.
項(xiàng)目四：iNOS基因表達(dá)
【評(píng)價(jià)原理】
NO 是一種活性高、不穩(wěn)定的小分子化合物，它對(duì)維護(hù)正常的細(xì)胞功能至關(guān)重要。在生理狀態(tài)下，NO 不僅是重要的神經(jīng)遞質(zhì)，還可以調(diào)節(jié)血管舒縮功能、減少血栓形成、清除自由基等。但在病理情況下，NO 是介導(dǎo)免疫過程和炎癥反應(yīng)的重要炎性因子。作為合成 NO的關(guān)鍵限速酶，一氧化氮合酶（nitrie oxidessynthase，NOS）一般分為兩類，即結(jié)構(gòu)型 cNOS( constitutive nitrie oxides synthase)和誘導(dǎo)型 iNOS( inducible nitric oxides synthase) 。其中，iNOS 主要位于巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞和炎癥區(qū)上皮細(xì)胞。與 cNOS 相比，健康狀態(tài)時(shí) iNOS 表達(dá)缺乏，只有在細(xì)胞被促炎細(xì)胞因子和/或細(xì)菌脂多糖刺激后才被誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)后的 iNOS可產(chǎn)生高于 cNOS 產(chǎn)生量 1000 倍的 NO，活性可以維持?jǐn)?shù)小時(shí)到數(shù)天。因此，本研究擬通過 LPS 體外誘導(dǎo)炎癥 Raw264.7 模型,檢測(cè)樣品處理后 iNOS 的基因表達(dá)水平，以此維度評(píng)價(jià)樣品的抗炎舒緩功效。
【實(shí)驗(yàn)方案】
實(shí)驗(yàn)一：MTT 法檢測(cè)樣品對(duì) Raw246.7 的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
1）細(xì)胞接種：接種細(xì)胞于 96 孔板內(nèi)（1 × 10^4個(gè)/孔），于 37 ℃，5% CO2中培養(yǎng) 24 h。
2）給藥：樣品組加入相應(yīng)濃度的含樣品的培養(yǎng)基，正常對(duì)照組更換為新鮮培養(yǎng)基，空白組加入空白培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育 24 h。
3）孵育結(jié)束后向每孔中加入 MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。
4）去培養(yǎng)液，加入 DMSO 溶液，振蕩混勻，測(cè)定 490 nm 處吸光度值。
OD490：490 nm 處的吸光度值
實(shí)驗(yàn)二：樣品對(duì) LPS 造模后的 Raw246.7 的 INOS 的表達(dá)情況
1）細(xì)胞接種：將 Raw246.7 以 6 × 10^5個(gè)/孔接種于 6 孔板，于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng) 12 h，分別設(shè)置對(duì)照組（0 μg/L+0 mM 樣品）、低濃度組（0.5 μg/L LPS+A mM 樣品）、中濃度組（0.5 μg/L LPS+B mM 樣品）、高濃度組（0.5 μg/L LPS+ C mM 樣品）
2）LPS 造模＋給藥：針對(duì)試驗(yàn)分組，對(duì)需要造模及給藥組分別進(jìn)行一定終濃度 LPS 和藥物處理 24 h±2 h；
3）細(xì)胞收集：培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行細(xì)胞收樣，提取各實(shí)驗(yàn)組總 RNA，合成 cDNA，利用 q-PCR檢測(cè)β-actin 和目的基因的基因表達(dá)。
4）用β-actin 作為基因表達(dá)的內(nèi)參，計(jì)算目的基因的 RNA 相對(duì)表達(dá)量。
【評(píng)價(jià)指標(biāo)】iNOS 基因表達(dá)
【評(píng)價(jià)結(jié)論】與模型對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組 iNOS 基因表達(dá)均且具有顯著性下調(diào)且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性（P＜0.05），初步證明樣品具有抗炎舒緩功效。
浙公網(wǎng)安備 33010802003447號(hào)