項(xiàng)目一：膠原蛋白含量測定
【評價原理】
成纖維細(xì)胞既合成和分泌膠原蛋白、彈性蛋白，生成膠原纖維、網(wǎng)狀纖維和彈性纖維，也合成和分泌糖胺聚糖和糖蛋白等基質(zhì)成分。III型膠原蛋白是真皮細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，在嬰兒和青少年皮膚中，I 型膠原蛋白的含量約占70%，而III型膠原蛋白占30%；皮膚皺紋的出現(xiàn)與膠原蛋白的正常合成和表達(dá)密切相關(guān)。人真皮成纖維細(xì)胞可以作為研究化妝品提升I和III型膠原含量的細(xì)胞模型，通過測定空白對照和樣品給藥后，I和III型膠原含量的上調(diào)率，評價供試品在促進(jìn)膠原蛋白合成方面是否具有功效。
【實(shí)驗(yàn)步驟】
實(shí)驗(yàn)一：MTT法檢測樣品對人成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
1）細(xì)胞接種：接種細(xì)胞于96孔板內(nèi)（1 × 10^4個/孔），于37 ℃，5% CO2中培養(yǎng)24 h。
2）給藥：樣品組加入相應(yīng)濃度的含樣品的培養(yǎng)基，正常對照組更換為新鮮培養(yǎng)基，空白組加入空白培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。
3）孵育結(jié)束后向每孔中加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。
4）去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液，振蕩混勻，測定490 nm處吸光度值。
OD490：490 nm處的吸光度值
實(shí)驗(yàn)二：I和III型膠原蛋白表達(dá)測定實(shí)驗(yàn)
細(xì)胞接種：將細(xì)胞接種96孔平板， 2×10^4個細(xì)胞/孔（37℃、5%CO2、），培養(yǎng)24h。
給藥：棄掉96孔板中的培養(yǎng)液，開展給藥操作。樣品組加入含有樣品的培養(yǎng)液，對照組加入不含樣品的細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔200 μL。給藥完畢后將96孔板放置在培養(yǎng)箱中（37℃、5%CO2）培養(yǎng)24h±2h。
3）III型膠原蛋白檢測：孵育結(jié)束之后收集細(xì)胞上清，使用人I和III型膠原酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行I和III型膠原蛋白含量的測定。
【評價指標(biāo)】
I和III型膠原蛋白含量
【評價結(jié)論】
在上述實(shí)驗(yàn)條件下，與空白對照相比，樣品可以使 I和III型膠原蛋白的含量上調(diào)，且具有顯著性差異（P<0.05），證明該供試品具有抗皺功效。
【參考文獻(xiàn)】
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項(xiàng)目二：基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的的表達(dá)
【實(shí)驗(yàn)原理】
皮膚衰老是個復(fù)雜的過程，其伴隨著含水量降低，新陳代謝減慢，免疫力下降等多個過程，皮膚衰老的特征是失去彈性、松弛、出現(xiàn)皺紋和粗糙的外觀等。己有大量的研究證明，紫外線照射后誘導(dǎo)人類皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶 ( MMPs) 增多，MMPs 降解膠原和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在皮膚光老化中起著重要作用。MMPs 是一類含有鋅離子、活性依賴于鈣離子的蛋白酶，具有廣泛的生物學(xué)活性。已知的 MMPs 成員有 24 種，主要可分為膠原酶 ( MMP-1，8，13 ) 、基質(zhì)溶解素( MMP-3，7，10，11) 、明膠酶 ( MMP-2，9) 等亞家族，不同的 MMPs 對細(xì)胞外基質(zhì)不同組分降解的特異性有所不同。人基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）是 MMPs 天然的特異性內(nèi)源性抑制劑，TIMPs 與 MMPs 的精密平衡在 ECM 的合成和降解中發(fā)揮著重要作用，皮膚皺紋的形成是二者動態(tài)平衡失調(diào)的結(jié)果。因此，本研究擬用通過樣品作用于皮膚成纖維細(xì)胞后，檢測MMP-1和TIMP-1的表達(dá)來評價樣品的抗皺功效。
【實(shí)驗(yàn)步驟】
1）細(xì)胞接種：將成纖維細(xì)胞以2 × 10^5個/孔接種于6孔板，于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)12 h，分別設(shè)置正常對照組（0 mJ/cm2+0 mM樣品）、模型對照組（5 J/cm2+0 mM樣品）、UVA照射低濃度組（5 J/cm2+A mM樣品）、UVA照射中濃度組（5 J/cm2 +B mM樣品）、UVA照射高濃度組（5 J/cm2 + C mM樣品）。
2）造模：UVA 造模：UVA 輻射前成纖維細(xì)胞用 D’Hanks 洗 3 遍，在孔中加入 1 ml D’Hanks，使之浸沒細(xì)胞，正常對照組用錫紙包住置暗處。針對試驗(yàn)分組，對需要輻射的組分別進(jìn)行 UVA造模；
3）給藥：按照各試驗(yàn)組分組，每次照射完成后進(jìn)行給藥處理培養(yǎng)24 h；
4）收樣：培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行細(xì)胞收樣，提取各實(shí)驗(yàn)組總RNA，合成cDNA，利用q-PCR檢測β-actin和目的基因的基因表達(dá)。
5）用β-actin作為基因表達(dá)的內(nèi)參，計(jì)算目的基因的RNA相對表達(dá)量。
注：本實(shí)驗(yàn)方法中的樣品的濃度因?qū)嶒?yàn)一結(jié)果而定。
【評價指標(biāo)】MMP-1和TIMP-1相對表達(dá)量
【評價結(jié)論】
與模型對照組相比，實(shí)驗(yàn)組中樣品對衰老細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶相關(guān)基因表達(dá)（MMP-1）顯著性下調(diào)、而其抑制基因（TIMP-1）顯著性上調(diào)（P＜0.05），初步證明樣品具有抗皺功效。
【參考文獻(xiàn)】
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