項目一：MMP-1含量
【實驗原理】
光老化主要由太陽光暴露、自由基和物理刺激引起。到達我們皮膚的紫外線主要由90-95%的UVA和5-10%的UVB組成，過度暴露于UVA/UVB與皮膚衰老相關(guān)。皮膚松弛、皺紋產(chǎn)生主要是真皮組織以及真表皮連接處（DEJ區(qū)）出現(xiàn)的問題 ，從成分和結(jié)構(gòu)來看，膠原蛋白含量減少及結(jié)構(gòu)紊亂。究其背后更深層次的原因：自由基的過量產(chǎn)生、蛋白質(zhì)羰基化和糖基化修飾、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的過度表達。已有研究表明，MMP-1 可以降解Ⅰ型和Ⅲ型等多種膠原纖維。因此，本實驗通過測定給藥后MMP-1含量，來評價樣品是否具有抗光老化功效。
【實驗方法】
實驗一：MTT法檢測樣品對人真皮成纖維細胞的細胞毒性實驗
1）細胞接種：接種細胞于96孔板內(nèi)（1 × 10^4個/孔），于37 ℃，5% CO2中培養(yǎng)24 h。
2）給藥：樣品組加入相應(yīng)濃度的含樣品的培養(yǎng)基，正常對照組更換為新鮮培養(yǎng)基，空白組加入空白培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。
3）孵育結(jié)束后向每孔中加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。
4）去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液，振蕩混勻，測定490 nm處吸光度值。
OD490：490 nm處的吸光度值
實驗二：樣品對UVA輻射后人真皮成纖維細胞的MMP-1的表達
細胞接種：將細胞以6 × 105個/孔接種于6孔板，于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)12 h，分別設(shè)置正常對照組（0 J/cm2+0 mM樣品）、模型對照組（5 J/cm2+0 mM樣品）、低濃度組（5 J/cm2+A mM樣品）、中濃度組（5 J/cm2+B mM樣品）、高濃度組（5 J/cm2 + C mM樣品）。
UVA造模：UVA輻射前細胞用D’Hanks洗3遍，在孔中加入 1 ml D’Hanks，使之浸沒細胞，對照組用錫紙包住置暗處。針對試驗分組，對需要輻射的組分別進行UVA造模（5 J/cm2）；
給藥：各試驗組中分別加入含有不同濃度樣品的 DMEM 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；
收樣及檢測：每孔取180μL培養(yǎng)上清，用 ELISA試劑盒檢測MMP-1的含量。
【評價指標】MMP-1含量
【評價結(jié)論】
供試品組與模型組相比，MMP-1含量降低且具有顯著性差異（P＜0.05），初步證明該供試品具有抗光老化功效。
【參考文獻】
[1]林榮鋒. 廣藿香油對UV所致小鼠皮膚光老化模型保護作用的實驗研究[D].廣州中醫(yī)藥大學.2015.
[2] Leccia MT, Richard MJ, Favier A, Béani JC. Zinc Protects Against Ultraviolet A l-lnduced DNA Damage and Apoptosis in Cultured Human Fibroblasts[J]. Biol Trace Elem Res. 1999,69(3)
[3] Abidullah khan, Hongliang Bai, Maoguo Shu. Antioxidative and antiphotoaging activities of neferine upon UV-A irradiation in human dermal fibroblasts[J]. Bioscience Reports .2018
項目二：ROS 清除率、SOD 酶活性和 GSH 含量
【實驗原理】
生物體進行呼吸代謝等氧化反應(yīng)會產(chǎn)生活性自由基，在正常機體環(huán)境下，自由基具有穩(wěn)定的清除系統(tǒng)，使得機體自由基含量保持較低濃度的平衡。氧化應(yīng)激（Oxidative Stress, OS）是指機體由于受到內(nèi)源性和（或）外源性刺激，使得體內(nèi)氧化與抗氧化作用間的平衡失常，自由基產(chǎn)生過多。過多的自由基在體內(nèi)產(chǎn)生一系列負面作用，可氧化損傷生物分子，并進一步引起細胞死亡和組織損傷等。生物體內(nèi)，除極微量的ROS被機體利用外，幾乎所有的ROS都應(yīng)當及時被清除。中波紅斑效應(yīng)紫外線 ( UVB) ( 280-319 nm) 輻射損傷是引起皮膚光老化最重要的因素，主要損傷皮膚角質(zhì)形成細胞 ( HaCaT)，具體表現(xiàn)為光產(chǎn)物積累、ROS上升及氧化損傷加劇等。生物體在長期的進化過程中形成了一套完整的抗氧化體系，使自由基的產(chǎn)生與消除處于動態(tài)平衡，是生物體的一種適應(yīng)性機制，主要成員包括抗氧化酶、抗氧化劑以及分隔過渡金屬的蛋白等，它們均可特異性地限制機體的氧化損傷。
其中，紫外線輻射誘發(fā)的氧化損傷與抗氧化酶（包括超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（CAT））的活性有密切關(guān)系。 例如，SOD可將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為低毒性的H2O2和O2，而CAT可進一步將H2O2分解為無毒性的H2O和O2。而谷胱甘肽（GSH）則屬于機體內(nèi)另一種非酶抗氧化劑之一。 谷胱甘肽（GSH）是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結(jié)合的三肽，GSH的結(jié)構(gòu)中含有一個活潑的巰基（-SH），易被氧化脫氫，這一特異結(jié)構(gòu)使其成為體內(nèi)主要的抗氧化劑。而且GSH是多種酶如GSH-Px的輔酶，涉及多種生物學過程，參與清除ROS，防護氧化應(yīng)激對機體產(chǎn)生的損傷。GSH的含量可在一定程度上反映機體的抗氧化能力。研究表明，GSH的缺失會破壞細胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致ROS累積，最終引發(fā)細胞損傷甚至死亡。因此，可以通過檢測UVB輻射后角質(zhì)形成細胞中ROS清除率、SOD活性和GSH含量，以此幾個維度指標初步判定樣品是否具有抗光老化功效。
【實驗方法】
實驗一：MTT法檢測樣品對HaCaT的細胞毒性實驗
1）細胞接種：接種細胞于96孔板內(nèi)（1 × 10^4個/孔），于37 ℃，5% CO2中培養(yǎng)24 h。
2）給藥：樣品組加入相應(yīng)濃度的含樣品的培養(yǎng)基，正常對照組更換為新鮮培養(yǎng)基，空白組加入空白培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。
3）孵育結(jié)束后向每孔中加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。
4）去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液，振蕩混勻，測定490 nm處吸光度值。
OD490：490 nm處的吸光度值
實驗二：MTT法檢測UVB不同輻射劑量對HaCaT的細胞毒性實驗
實驗方法參考實驗一
實驗三：樣品對UVB輻射后HaCaT的ROS清除效率
細胞接種：將HaCaT以2 × 10^4個/孔接種于96孔板，于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)12 h，分別設(shè)置對照組（X mJ/cm2+0 mM樣品）、低濃度組（X mJ/cm2+A mM樣品）、中濃度組（X mJ/cm2+B mM樣品）、高濃度組（X mJ/cm2 + C mM樣品）陽性藥組（X mJ/cm2 + N-乙酰-L-半胱氨酸）。
UVB造模：UVB輻射前HaCaT用D’Hanks洗3遍，在孔中加入 50 ul D’Hanks，使之浸沒細胞，對照組用錫紙包住置暗處。針對試驗分組，對需要輻射的組分別進行UVB造模；
給藥：各試驗組中分別加入含有不同濃度樣品的 DMEM 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；
ROS熒光探針轉(zhuǎn)載：按照1:1000的稀釋比例，采用PBS稀釋DCFH-DA至終濃度為10 μmol/L。除裸細胞孔外，棄掉其余孔中的培養(yǎng)基，用PBS清洗3次后，每孔加入200 ul DCFH-DA工作液，CO2培養(yǎng)箱孵育30 min，孵育結(jié)束后，PBS清洗各孔內(nèi)細胞3次；
5） 熒光分析。將待測96孔板置于熒光酶標儀檢測臺上，設(shè)置入射光波長525 nm，激發(fā)光波長488 nm，讀數(shù)分析。
6） 計算。根據(jù)各組實驗熒光強度，計算樣品對ROS的清除效率。
注：本實驗方法中的樣品的濃度和輻射劑量因?qū)嶒炓缓投Y(jié)果而定。
實驗四：樣品對UVB輻射后HaCaT中SOD活性影響
細胞接種：將HaCaT以1×106個細胞/孔接種于6孔板，于培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）中培養(yǎng)12 h，分別設(shè)置對照組（X mJ/cm2+0 mM樣品）、低濃度組（X mJ/cm2+A mM樣品）、中濃度組（X mJ/cm2+B mM樣品）和高濃度組（X mJ/cm2+C mM樣品）。
2）UVB造模：UVB輻射前HaCaT用D’Hanks洗3遍，在每個培養(yǎng)皿中加入 1ml D’Hanks，使之浸沒細胞。對各組進行X mJ/cm2 UVB造模；
3）給藥：照射后，立即去除D’Hanks，根據(jù)試驗分組加入不同濃度樣品的 DMEM 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；
4）收集細胞：培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞樣，進行后續(xù)SOD活性測定（具體流程參考SOD酶活性試劑盒說明書）；
注：本實驗方法中的樣品的濃度和輻射劑量因?qū)嶒炓缓投Y(jié)果而定。
實驗五：樣品對UVB輻射后HaCaT中GSH含量影響
細胞接種：將HaCaT以1×10^6個細胞/孔接種于6孔板，于培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）中培養(yǎng)12 h，分別設(shè)置對照組（X mJ/cm2+0 mM樣品）、低濃度組（X mJ/cm2+A mM樣品）、中濃度組（X mJ/cm2+B mM樣品）和高濃度組（X mJ/cm2+C mM樣品）。
2）UVB造模：UVB輻射前HaCaT用D’Hanks洗3遍，在每個培養(yǎng)皿中加入 1ml D’Hanks，使之浸沒細胞。對各組進行X mJ/cm2 UVB造模；
3）給藥：照射后，立即去除D’Hanks，根據(jù)試驗分組加入不同濃度樣品的 DMEM 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；
4）收集細胞：培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞樣，進行后續(xù)GSH含量測定（具體流程參考GSH含量測定試劑盒說明書）；
注：本實驗方法中的樣品的濃度和輻射劑量因?qū)嶒炓缓投Y(jié)果而定。
【評價指標】
ROS清除率、SOD酶活性及GSH含量
【評價結(jié)論】
1、與對照組相比，實驗組中樣品對ROS的清除率、SOD酶活性及GSH含量均且具有顯著性上調(diào)且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性（P＜0.05），初步證明樣品具有抗光老化功效。
【參考文獻】
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