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項目一：細胞活性保護比率
【實驗原理】
藍光波長比紫外線長，具有較強的穿透力，能夠穿透皮膚表皮抵達真皮層,引起一系列的炎癥反應和線粒體損傷，最終誘導細胞的凋亡甚至腫瘤的發(fā)生。采用藍光光源照射人永生化角質(zhì)形成細胞HaCaT，會出現(xiàn)一定的細胞毒性，抑制細胞增殖。計算添加和不添加樣品對于細胞的保護比率，以此評價樣品是否具有藍光防護功效。
【實驗步驟】
實驗一：MTT法檢測某化妝品對HaCaT的細胞毒性實驗
1）細胞接種：接種細胞于96孔板內(nèi)（1×10^4 個/孔），于37 ℃，5% CO2中培養(yǎng)24 h。
2）給藥：樣品組加入相應濃度的含樣品的培養(yǎng)基，正常對照組更換為新鮮培養(yǎng)基，空白組加入空白培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。
3）孵育結(jié)束后向每孔中加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。
4）去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液，振蕩混勻，測定490 nm處吸光度值。
OD490：490 nm處的吸光度值
實驗二：MTT法檢測某化妝品抗藍光保護
1）細胞接種：準備2塊96孔板，將HaCaT細胞以1×10^4的密度接種于96孔板中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。1號板設置為未添加樣品的非光照組，2號板設置為未添加樣品的光照組（模型組）和添加樣品的光照組。
2）給藥：細胞培養(yǎng)24 h后，取出2號板，加樣品處理，另設空白對照（無細胞+完全培養(yǎng)基）,然后將2塊板放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。
3）造模：將2號板放入藍光暗箱里照射3 h，1號板繼續(xù)在37 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)3 h。
4）收樣檢測：照射結(jié)束后，MTT法測定490 nm處吸光度值。根據(jù)OD值計算細胞活性保護比率（A）。
式中：
A：細胞活性保護比率；
CV：細胞活力值；
CVd1：添加樣品的光照組細胞的細胞活力值；
CVe1：未添加樣品的光照組細胞的細胞活力值；
CVe0：未添加樣品的非光照組細胞的細胞活力值；
【評價指標】保護比率（A）
【評價結(jié)論】A ≥ 1.5，判定為樣品在該濃度下具有藍光防護能力。
【參考文獻】
[1] GB/T 38120-2019,藍光防護膜的光健康與光安全應用技術要求[S].
[2] 夏艾婷.葉黃素對藍光誘導皮膚成纖維細胞損傷的保護作用及其機制的研究[D].安徽醫(yī)科大學.
項目二：ROS清除率
【實驗原理】
皮膚位于人體的最外層，保護我們免受各種外部因素的影響，包括陽光、污染物和壓力。陽光是影響皮膚的最大因素之一，主要由紫外線(UV)、可見光和紅外光組成，具體取決于能量和波長。在各種波長中，由于智能手機、筆記本電腦、電腦和電視等電子設備在日常生活中的廣泛使用，藍光(380-500納米)，也稱為高能可見光，尤其受到關注。據(jù)報道，過度暴露于藍光會對皮膚細胞造成多種損傷，包括氧化應激、細胞凋亡和增殖能力下降等。。因此，本實驗擬檢測ROS清除率，以此維度判斷樣品是否具有抗藍光保護作用。
【實驗方法】
實驗一：MTT法檢測某化妝品對HaCaT的細胞毒性實驗
1）細胞接種：接種細胞于96孔板內(nèi)（1×10^4 個/孔），于37 ℃，5% CO2中培養(yǎng)24 h。
2）給藥：樣品組加入相應濃度的含樣品的培養(yǎng)基，正常對照組更換為新鮮培養(yǎng)基，空白組加入空白培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。
3）孵育結(jié)束后向每孔中加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。
4）去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液，振蕩混勻，測定490 nm處吸光度值。
OD490：490 nm處的吸光度值
實驗二：樣品對藍光輻射后HaCaT的ROS清除效率
1) 細胞接種：將HaCaT以2 × 10^4個/孔接種于96孔板，于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)12 h，分別設置正常對照組（0 mM樣品）、模型對照組（藍光輻射3 h+0 mM樣品）、低濃度組（藍光輻射3 h+A mM樣品）、中濃度組（藍光輻射2 h+B mM樣品）、高濃度組（藍光輻射3 h + C mM樣品）。
2) 給藥預處理：各試驗組中分別加入含有不同濃度樣品的 DMEM 培養(yǎng)基中預培養(yǎng)24 h；
3) 藍光造模：藍光輻射前HaCaT用D’Hanks洗3遍，在孔中加入 50 ul D’Hanks，使之浸沒細胞，對照組用錫紙包住置暗處。針對試驗分組，對需要輻射的組分別進行藍光造模 3 h；
4) 給藥：各試驗組中分別加入含有不同濃度樣品的 DMEM 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；
5) ROS熒光探針轉(zhuǎn)載：按照1:1000的稀釋比例，采用PBS稀釋DCFH-DA至終濃度為10 μmol/L。除裸細胞孔外，棄掉其余孔中的培養(yǎng)基，用PBS清洗3次后，每孔加入200 ul DCFH-DA工作液，CO2培養(yǎng)箱孵育30 min，孵育結(jié)束后，PBS清洗各孔內(nèi)細胞3次；
6） 熒光分析。將待測96孔板置于熒光酶標儀檢測臺上，設置入射光波長525 nm，激發(fā)光波長488 nm，讀數(shù)分析。
7） 計算。根據(jù)各組實驗熒光強度，計算樣品對ROS的清除效率。
注：本實驗方法中的樣品的濃度和輻射劑量因?qū)嶒炓欢ā?/p>
【評價指標】ROS清除率
【評價結(jié)論】
與模型對照組相比，實驗組中樣品對ROS的清除率具有顯著性上調(diào)且呈現(xiàn)劑量相關性（P＜0.05），初步證明樣品具有抗藍光保護作用。
【參考文獻】
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