【評價(jià)原理】
光毒性是指皮膚第1次接觸光敏性物質(zhì)后，在無害的日光照射強(qiáng)度下誘發(fā)的異常皮膚反應(yīng)，通常發(fā)生在暴露于光照下的皮膚區(qū)域，表現(xiàn)為急性發(fā)病，類似于曬斑，嚴(yán)重會(huì)產(chǎn)生皮膚刺激、紅斑、瘙癢、水腫。中性紅是一種弱的陽離子染料，極易以非離子擴(kuò)散的方式穿透細(xì)胞膜，并在細(xì)胞溶酶體內(nèi)聚集。某些化學(xué)物質(zhì)和外界條件作用可引起細(xì)胞表面或溶酶體膜敏感性的改變，導(dǎo)致溶酶體脆性增高等不可逆的細(xì)胞毒性變化，從而導(dǎo)致細(xì)胞吸收中性紅的能力下降。供試品和紫外線照射聯(lián)合作用3T3成纖維細(xì)胞后，測定細(xì)胞吸收中性紅的能力來判斷供試品是否具有光毒性。
【實(shí)驗(yàn)方法】
接種96孔平板：104個(gè)細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24h（37℃、5%-7.5% CO2）。去除培養(yǎng)液，用150μL EBSS/PBS輕柔沖洗細(xì)胞一次或兩次。分別用100μL 8種不同濃度的受試物處理細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞1h（37℃、5%-7.5% CO2）。室溫下暴露于有光照（+Irr）（1.7 mW/cm2）50分鐘（即5J/cm2）另一個(gè)平板置于黑暗環(huán)境50分鐘。用150μL EBSS或PBS仔細(xì)沖洗細(xì)胞兩次，再用培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞（37℃、5%-7.5% CO2、18h-22h過夜）。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；去除培養(yǎng)液，用150μL EBSS或PBS沖洗細(xì)胞一次或兩次，加入100μL含50 μg/mL中性紅的培養(yǎng)液培（37℃、5%-7.5%CO2、3h）。去除中性紅培養(yǎng)液，用150μL EBSS或PBS沖洗細(xì)胞一次或兩次，加入150μL中性紅解吸附溶液。震蕩平板10分鐘。檢測在540nm波長下細(xì)胞對中性紅的吸收情況（反映細(xì)胞活性）。
1、通過分析在有光照（+Irr）和無光照（-Irr）兩種情況下獲得的細(xì)胞毒性濃度反應(yīng)曲線，確定能抑制50%細(xì)胞活性的受試物濃度（IC50），按下列公式計(jì)算光刺激因子（PIF）。
PIF＝IC50（-Irr）/ IC50（+Irr）
評判標(biāo)準(zhǔn)：PIF≤2：預(yù)測“無光毒性”；PIF≥5：預(yù)測“有光毒性”。PIF介于2-5之間，需進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)；如果PIF仍介于2-5之間，預(yù)測“有潛在光毒性”。
如果受試物在有光照（+Irr）時(shí)有細(xì)胞毒性，無光照（-Irr）時(shí)無細(xì)胞毒性，且細(xì)胞毒性試驗(yàn)所使用的濃度已達(dá)最高受試濃度（Cmax）時(shí)，可按照下列公式計(jì)算＞PIF：
＞PIF＝Cmax（-Irr）/ IC50（+Irr）
評判標(biāo)準(zhǔn)為：如果只獲得一個(gè)“＞PIF”，那么任何＞PIF ＞1的值都能提示“有潛在光毒性”。
2、通過在濃度網(wǎng)格上比較有光照（+Irr）和無光照（-Irr）兩種情況下獲得的細(xì)胞毒性濃度反應(yīng)曲線（i＝1，….，N）可得到平均光效應(yīng)（MPE），細(xì)胞毒性濃度反應(yīng)曲線的染毒濃度需在有光照（+Irr）和無光照（-Irr）試驗(yàn)共有的濃度范圍內(nèi)選擇。濃度Ci的光效應(yīng)（PEi）等于濃度效應(yīng)（CEi）和反應(yīng)效應(yīng)（REi）的乘積。使用專門的軟件“PHOTO32或更高版本”求得平均光效應(yīng)（MPE），建立以平均光效應(yīng)（MPE）為基礎(chǔ)的預(yù)測模型。通過將MPE與臨界閾值MPEc比較，預(yù)測化學(xué)物潛在光毒性的預(yù)測模型。
閾值MPEc＝0.1
評判標(biāo)準(zhǔn)：
如果MPE≤0.1：預(yù)測無潛在光毒性；
如果MPE≥0.15：預(yù)測有潛在光毒性。
如果MPE介于0.1—0.15之間，需進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)；如果MPE仍介于0.1—0.15之間，預(yù)測有潛在光毒性。
【評價(jià)指標(biāo)】
光刺激因子（PIF）、平均光效應(yīng)（MPE）
【結(jié)果展示】（僅供參考，實(shí)際實(shí)驗(yàn)組別依據(jù)合同而定）
表1、光毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
【評價(jià)結(jié)論】
1、幾種供試品經(jīng)測試后，光刺激因子PIF＜2，平均光效應(yīng)MPE≤0.1, 說明這幾種供試品無光毒性。
【參考文獻(xiàn)】
[1] KIM K, PARK H, LIM K M. Phototoxicity: its mechanism and animal alternative test methods[J]. Toxicol Res, 2015, 31(2): 97-104.
[2] Organization for Economic Cooperation and Development (OECD), 2004[S]. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals Test No. 432. In vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test.
[3] 段名揚(yáng), 康樺, 桑晶, 等. 應(yīng)用優(yōu)化的3T3 細(xì)胞中性紅攝取試驗(yàn)評價(jià)6 種化妝品的光毒性[J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2021, 38(11): 1309-1313.
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